城鎮污水廠是生活污水和工業廢水排入自然水體前至關重要的末端處理環節，特別是在一些飲用水水源地上游地區，對氮排放的要求更加嚴格。硝化過程是城鎮污水廠生物脫氮的第一步，硝化菌是此過程的決定性微生物。當城鎮污水廠硝化功能崩潰時，硝化菌的活性會受到抑制，導致出水氨氮升高。目前一般采用降低污泥負荷、延長污泥齡等措施進行恢復，但耗時長達3~6個月，恢復期內污水廠出水水質不能穩定達標。

載體富集硝化菌能夠使硝化菌群高度集中，并且載體中的硝化菌可以形成生物膜，因此其更加穩定、不易流失。筆者通過考察載體富集硝化菌群的反應比速率、活性比值、掛膜量和微生物多樣性等指標，篩選最優載體，可為縮短污水廠恢復周期、提高污水廠抗沖擊能力提供參考。

1、材料與方法

1.1 實驗條件

本實驗以MBBR型、纖維球、細菌球三種材料為載體（載體參數見表1），分別放入不銹鋼網孔焊筒容器中，在河北省某縣城污水處理廠的曝氣池進行掛膜，實驗過程中保證容器懸浮于生化池內，防止積泥。實驗總時長為58d。該生化池采用百樂克（BIOLAK）工藝，進水氨氮為15~30mg/L，出水氨氮為0.78~1.42mg/L；主要運行參數：污泥濃度為3785~5773mg/L，好氧池溶解氧濃度為2~4mg/L，溫度為21~27℃。

1.2 微生物活性分析實驗

每周進行一次微生物活性（反應比速率）實驗，分別取1L（填充體積）載體和活性污泥放入燒杯中，再加入污水廠穩定池出水至3L。實驗開始時加入400mg/L的碳酸氫鈉、30mg/L的碳酸氫銨和8mg/L的亞硝酸鈉作為反應基質，以硫酸/碳酸氫鈉調節pH值為6~8。實驗過程中采用曝氣頭和空氣泵進行曝氣，使溶解氧≥3mg/L，每1h取樣一次，經0.45μm濾膜過濾后測定氨氮、硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮濃度，并計算氨氧化菌（AOB）和亞硝酸鹽氧化菌（NOB）的容積速率和反應比速率。

1.3 分析項目及方法

NH3-N采用納氏試劑法測定，NO3--N采用紫外分光光度法測定，NO2--N采用分光光度法測定。活性污泥和載體中微生物的多樣性采用Illumina高通量測序方法進行測定。活性污泥和載體的MLSS和MLVSS均采用國標法測定。

1.4 微生物種群及多樣性分析

實驗結束時分別從活性污泥、MBBR型載體、細菌球載體、纖維球載體中提取污泥或生物膜，以8000r/min離心10min，將濃縮的污泥或生物膜保存在-20℃的冰箱中進行DNA樣品分析。

使用PowerSoilDNA提取包從樣品中提取微生物總DNA。采用分光光度計測定230nm、260nm和280nm處的吸光度值，然后計算260nm/280nm和260nm/230nm的吸光度比值來評估DNA，并且在-80℃下保存DNA。采用通用引物（正向引物：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'；反向引物：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）與銜接子序列和條形碼序列進行組合擴增細菌16SrRNA基因的V3-V4區域。

PCR產物通過VAHTSTMDNACleanBeads進行純化，然后在反應中進行第二輪PCR，最后用Quant-it?dsDNAHS試劑對所有PCR產物進行定量，并將其聚合在一起，對純化的混合樣本進行細菌16SrRNA基因的高通量測序分析。

2、結果與討論

2.1 不同載體對AOB和NOB活性的影響

不同載體對AOB和NOB活性的影響見圖1。

由圖1可知，MBBR型、纖維球、細菌球三種載體隨著掛膜時間的延長，AOB的反應比速率在35d左右達到峰值，NOB的反應比速率在28d左右達到峰值，而后呈現下降的趨勢。這是由于載體結構相對固化，生物膜不斷生長、老化且不易脫落，而新的生物膜難以形成。掛膜35d時，MBBR型、纖維球、細菌球載體的AOB反應比速率分別為1.93、2.18、2.72mg/（gVSS·h），活性污泥中AOB的比速率為1.91mg/（gVSS·h），三種載體分別比活性污泥提高了0.1%、14.1%、42.41%，說明載體比活性污泥具有更高的AOB比速率，其中細菌球掛膜載體的AOB比速率最高。理論上，按50%的填充體積投加實驗掛膜載體，其AOB反應比速率可分別提高50.5%、57.1%、71.2%。

掛膜28d時，MBBR型、纖維球、細菌球的NOB反應比速率分別為1.00、1.46、1.68mg/（gVSS·h），與AOB一樣，細菌球載體的NOB反應比速率在三種載體中最高。經計算活性污泥中NOB的反應比速率為1.88mg/（gVSS·h）。載體上NOB的反應比速率均比活性污泥的低，主要是由于載體具有一定程度的選擇性，且在生物膜中NOB處于更靠近載體的空間，溶解氧擴散至NOB要通過外層的AOB，因此導致生物膜中NOB的活性比沒有傳質阻礙的活性污泥絮體中的低。另外，可能是由于該污水處理廠生化池中溶解氧有一定的波動，而NOB對環境較為敏感，其生長受到抑制。理論上，按50%的填充體積投加實驗掛膜載體，其NOB的反應比速率可分別提高26.6%、38.8%、44.7%。

掛膜35d時，MBBR型、纖維球、細菌球載體中AOB的容積速率分別為0.46、0.75、1.18mg/（L·h），可見細菌球富集AOB的效果更好。掛膜28d時，MBBR型、纖維球、細菌球載體中NOB的容積速率分別為0.22、0.88、0.55mg/（L·h），纖維球的NOB富集量最多。由于三種載體的掛膜生物量均比活性污泥低，因此，實驗期間三種填料的容積速率均比活性污泥低。

2.2 不同載體對AOB/NOB值的影響

AOB作用于生物脫氮中硝化反應的第一步，是脫氮效率的限制因素，而通常系統中的NOB不論是在數量上，還是多樣性上都比AOB更好。因此，系統中AOB與NOB的比值越高，證明AOB活性越好，脫氮率越高。經計算，活性污泥AOB/NOB值接近于1，這與王正富和卞偉等的研究一致。關于載體生物膜，王榮昌等和Noda等研究發現，生物膜厚度為80~120μm時，AOB和NOB主要分布在生物膜表面25~35μm范圍內，可以更好地利用水體中的營養物質進行生長繁殖。同時，當AOB/NOB值大于2時，可以較好地提高系統中的好氧速率，有利于系統中硝化反應的進行；MBBR型、纖維球、細菌球載體AOB/NOB值分別為1.71、1.70、2.10，可見三種載體均可大幅度提高系統的硝化反應比速率。通常情況下，生化池中無法監測到亞硝酸鹽的積累，由此說明在活性污泥系統中NOB的活性大于AOB的活性，因此可以驗證AOB確實是系統中的限制性因素，適當提高系統中AOB的比例有助于提高硝化菌的處理效率。綜上可知，細菌球掛膜載體有較高的AOB/NOB值，因此在硝化反應中更有優勢。

2.3 時間對掛膜量的影響

時間對掛膜量的影響見圖2?？芍S著掛膜時間的延長，單位填充體積載體的掛膜量逐漸增多。0~35d時，纖維球、細菌球掛膜量先增加后趨于穩定，掛膜量分別為1.87、2.38g/L；而該階段MBBR型載體的掛膜量處于穩步增長階段。結合圖1中AOB和NOB反應比速率先升后降可知，纖維球、細菌球掛膜量的增長趨勢減緩可以進一步驗證載體在系統中無法形成流態，造成生物膜產生一定程度的老化且不易脫落，新的生物膜難以形成；而MBBR型載體生物膜中AOB和NOB的反應比速率均較低，其掛膜量雖然在增長，但硝化菌群的反應比速率并未明顯提高。35~56d時，三種載體的掛膜量雖有不同程度的增加，但結合圖1的反應比速率可知，繼續增加的生物膜無法進一步提高硝化反應效率。該掛膜階段說明細菌球載體的生物膜最有效。

2.4 微生物種類及數量分析

通過高通量測序結果可知，活性污泥和不同載體的多樣性指數有一定的差別（見表2）。三種載體的Shannon指數均高于活性污泥，表明載體中微生物的物種多樣性更高，群落的復雜程度更高。細菌球的物種多樣性最高，可由最高的Shannon指數和最低的Simpson指數證明。因此，當向污水廠生化系統中投加細菌球載體時，可以明顯增加系統的生物多樣性，主要原因是載體的污泥齡更長（一般30d左右），可為微生物的進化提供時間和空間。

通過高通量測序，在科水平上對活性污泥及不同載體生物膜進行分析，發現2種硝化螺旋菌科，即Nitrosomonadaceae、Nitrospiraceae。Nitrosomonadaceae作為主要的AOB菌科，其在活性污泥、MBBR型、細菌球、纖維球上的相對豐度分別為1.39%、2.23%、2.53%、1.92%；Nitrospiraceae作為主要的NOB菌科，在活性污泥、細菌球、MBBR型、纖維球上的相對豐度分別為2.08%、4.87%、2.97%、3.10%。屬水平上的分析表明，Nitrospira作為最主要的硝化菌屬，在活性污泥、MBBR型載體、細菌球載體、纖維球載體中的相對豐度分別為2.47%、4.07%、2.83%、3.02%，表明載體在掛膜過程中富集了更多的硝化菌，且在三種載體中MBBR型載體上的Nitrospira相對豐度最高（見圖3）。

同時，研究發現部分細菌兼具AOB和NOB作用，可以將底物由氨氮直接轉化為硝酸鹽，適宜生存在低氨氮環境中，可作為出水指示性微生物。具備該功能的微生物一部分隸屬于Nitrospira屬，但是與龐大的Nitrospira屬相比，已發現的硝化菌種類較少，因此出于簡化模型考慮，此處假設該菌屬為NOB的一種，且在活性污泥和生物膜中均為優勢菌種。在活性污泥和載體生物膜中的優勢AOB菌種為Nitrosomonas，且在載體中的相對豐度較高，因此可以得出，載體在選擇性富集硝化菌方面起到了良好的作用。

在污水廠生化池馴化掛膜情況下，細菌球載體相對更易于硝化菌群的附著，細菌球載體和活性污泥中硝化菌群總占比分別為7.40%和3.47%，富集效率高達2.1倍。因此通過以上結果可以得出，載體可以選擇性地有效富集硝化菌群，且細菌球載體的富集效率最高。

3、結論

①細菌球載體對硝化菌群富集效果最好，最佳掛膜時間在30d左右。

②細菌球載體的AOB/NOB值最高可達2.10，相比活性污泥的AOB/NOB值（1左右），載體選擇性富集了更多的AOB。

③細菌球掛膜載體的AOB和NOB反應比速率分別達到2.72和1.68mg/（gVSS·h），作為限制性因素的AOB比活性污泥提高了42.41%。理論上，按50%的填充體積投加細菌球掛膜載體時，活性污泥中AOB的反應比速率可提高71.2%，NOB的反應比速率可提高44.7%。

④高通量測序結果表明，細菌球載體中硝化菌數量占比高達7.40%，與活性污泥中的硝化菌含量相比富集效率高達2.1倍。相比活性污泥，載體生物膜中的菌群更加多樣化，因此增加了系統的穩定性和抗沖擊性。